纯钽表面微弧氧化“类骨小梁”状多孔 涂层的细胞相容性
发布时间:
2024-09-30
钽由于其优异的生物相容性、耐蚀性及良好的力学性能被广泛地应用于医用植入材料领域[1-2]。其中多孔钽的形状与人体骨小梁的结构相似，被称为骨小梁金属，其特点是弹性模量较低，介于人体皮质骨和松质骨之间，与人体骨组织相接近的弹性模量可以有效降低人体应力屏蔽效应[3-5]。多孔钽的孔隙率在75%~80%，高的孔隙率使其具有良好的渗透性，更高的组织向内生长潜力，有利于骨整合[6-7]。多孔钽目前主要应用于股骨头坏死、关节置换、骨缺损等领域[8-9]。
钽高稳定的化学性质（生物惰性）会延迟其与骨组织的有效结合，有可能是植入物松动的主要原因[10]。因此需要对钽进行表面改性，提高其生物活性。提高生物材料表面活性的方法有引入活性元素[11-12]和改善表面粗糙度等[13-14]。其中，微弧氧化（MAO）作为一种重要的表面改性方法，既可以改善表面粗糙度，也可以方便地引入活性元素[15-16]。如Li等[17]使用微弧氧化方法在纯钛表面制备出多孔粗糙的TiO2涂层的同时，成功将活性元素Ca和Sr引入涂层，并证明了这种涂层提高了成骨细胞在其表面的粘附和铺展性能。另外，以原位生长为特征的微弧氧化涂层与基体的结合力好，耐磨性以及耐腐蚀性高，涂层功能及结构的设计性优，处理复杂器件内外表面的能力强[18-20]。
在制备植入物时，减少植入物和人体自然骨的差异可以增强骨植入的效果，利用仿生原理构建微纳米分级结构为当前趋势之一。微米/纳米分级结构可以调控成骨细胞的粘附、增殖、分化，有利于成骨基因的表达[21-22]。有研究证明，植入体表面与细胞尺寸相当的微米尺度结构可以增强细胞与植入体的接触面积，影响细胞的粘附和铺展，进而影响细胞的增殖以及成骨分化能力[23]。纳米尺度的结构则是对应于蛋白质和骨矿物质的尺寸，表面纳米尺度结构可以增加蛋白质粘附的位点，进而直接增强细胞粘附、增殖和分化能力[24]。微弧氧化表面改性方法可以在纯钛的表面制备出微米级沟槽与亚微米以及纳米级孔洞结合的涂层，该涂层在后续生物实验中同样被证明具有优异的成骨分化能力以及骨整合能力[25]。
关于纯钽表面微弧氧化处理以提高其生物活性的工作也有报道。Cheng等[26]使用硅酸盐对纯钽进行了微弧氧化，在涂层中引入Si元素，提高了材料表面的生物活性。Wang等[27]则在醋酸钙和β甘油磷酸钙中进行了微弧氧化，将Ca和P掺入了涂层，并探究了涂层形貌、生长行为等随微弧氧化时间的变化。李振宗等[28]在硅酸盐以及磷酸盐体系中对多孔钽进行了微弧氧化，之后进行了碱处理。结果表明，复合处理后，由于在Ta2O5表面引入了羟基功能团，使之具有优异的生物相容性和成骨性能。
上述针对纯钽微弧氧化所获得的涂层结构多为单级“火山坑”状结构，且研究的重点是如何在其表面引入活性元素或活性基团，而不同微弧氧化形貌结构对其活性的影响关注较少。本研究组在近期工作中成功利用四硼酸盐电解液在纯钽表面制备出“类骨小梁”状多孔分级涂层，为探究该仿生结构涂层对纯钽生物活性的影响，并比较不同形貌状态在细胞相容性上的差异，本文以纯钽抛光态表面为参照，对比分析了该涂层与“火山坑”状微弧氧化涂层在涂层物相组成、涂层结合力、粗糙度和亲水性指标上的差异，并表征了小鼠前成骨细胞在3种表面上的铺展、增殖和成骨分化的能力。
1 材料和方法
1.1 样品制备
采用线切割将钽棒切为φ10mm×2mm的钽片，并依次使用#200、#400、#800、#1000的砂纸打磨干净，然后分别使用丙酮、酒精、去离子水进行超声清洗。微弧氧化所用电源为双极性脉冲电源（WHD-20，哈尔滨工业大学）。实验使用清洗好的钽片作为阳极，使用不锈钢容器作为阴极。电解液选用0.1mol/LNa2B4O7，对应的样品命名为B-MAO。电源参数设置为恒流4A，占空比为9%，频率为600Hz。为了对比不同微弧氧化形貌对细胞相容性的影响，本实验选取0.05mol/LNa3PO4电解液制备的样品（P-MAO）作为对照组，对照组电源参数设置为恒流12A，占空比为9%，频率为600Hz。反应过程中使用机械搅拌进行散热。
1.2 涂层形貌以及物相表征
对涂层的表面以及截面使用扫描电镜（SEM，Supra55，Zeiss，德国）进行分析。使用X射线衍射仪（XRD，Empyrean，PANalyticalB.V，荷兰），在40kV下用Cu-Kα辐照(λ=0.154056nm），步长为0.04°,扫描（2θ)范围为20°~80°,确定涂层的相结构。使用X射线光电子能谱（XPS，ESCALABXI+，Thermo，英国）对涂层的化学价态进行分析。XPS测试采用Al-Kα辐射源（hυ=1486.6eV），测试之前，通过氩离子束蚀刻样品表面1min，以减少可能的碳污染，以C1s（284.8eV）作为基准峰校准所有能量值。XPS结果通过XPSpeak4.1软件进行分峰拟合。
1.3 涂层结合力测试
使用十字划格附着力测试仪来测定微弧氧化涂层与基体之间的结合力，测试方法为ASTM法（ASTMD3359-B），该测试方法适用于金属基体。首先是在涂层的表面使用均匀的压力划出切口，该切口沿2个相互正交的方向，并确保切口深度需达到基体的表面。划出切口后使用软刷刷去涂层表面脱落物。通过对比ASTM法评级标准，评估涂层附着力等级，使用SEM记录切口表面形貌。
1.4 表面粗糙度和亲水性测试
使用三维激光共聚焦扫描显微镜（CLSM，OLS4000，Olympus，日本）测量样品表面的三维立体特征，并且在20倍的物镜下测量涂层表面的粗糙度。使用接触角仪（DSA100，KRÜSS，德国）测量样品的水接触角，使用2μL的水滴，选取水滴接触涂层后240ms的接触角。实验选取样品各5个，并分别在样品表面选取5个点进行测试，并舍去差异较大的点，然后计算平均值。
1.5 细胞相容性测试
1.5.1 细胞培养
本试验采用小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1，中国科学院细胞库）直接接触培养，所用培养基为α-MEM完全培养基，其由α-MEM培养基（索莱宝科技有限公司，北京）添加10%胎牛血清（FBS）和1%的双抗（100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素硫酸盐）配制而成。细胞培养箱（HERAcell150i，ThermoScientific，德国）保持37℃恒温以及含有5%二氧化碳的气体环境，细胞培养过程中，每2~3d更换完全培养基，细胞长至培养瓶80%左右进行细胞传代。1.5.2样品准备
将微弧氧化后以及抛光的样品进行灭菌处理。首先将样品超声清洗15min，然后将清洗完毕的样品在120℃的高温灭菌器中高温高压灭菌30min，取出后放进真空干燥箱中进行干燥，干燥后的样品取出后两面分别于紫外光下照射12h。灭完菌后的样品放置于无菌操作台中备用。
1.5.3 细胞铺展
以2×104/mL的密度将细胞接种至样品涂层表面，在二氧化碳培养箱中分别培养1、2、4h，使用鬼笔环肽荧光素（FITC，碧云天生物技术有限公司，上海）进行细胞骨架染色，染色后的细胞F型肌动蛋白表现出绿色荧光，然后通过荧光显微镜（BX51，Olympus，日本）进行细胞初期铺展情况观察。以2×104/mL的细胞密度将细胞接种至样品表面，在二氧化碳培养箱中分别培养2、4、24h后，使用4%多聚甲醛对细胞进行固定，使用梯度浓度乙醇（质量分数分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%）对细胞进行脱水，在室温下干燥后，使用SEM观察涂层结构对细胞铺展情况的影响。
1.5.4 细胞增殖
以2×104/mL的密度将细胞接种至样品涂层表面，培养1、3、5d后，加入细胞计数试剂盒（CCK-8，索莱宝科技有限公司，北京），在恒温下培养3.5h，然后将培养后的液体转移至96孔板中，使用酶标仪（SynergyH1，ThermoScientific，美国）检测其在450nm波长下的吸光度。吸光度与细胞数量和活性具有线性关系。
1.5.5 碱性磷酸酶活性（ALP活性）
ALP是细胞早期成骨标志物，其活性大小与已成骨分化细胞的含量正相关。使用ALP检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海）对其成骨分化能力进行测定，以2×104/mL的密度将细胞接种至样品表面，在完全培养基中培养3d后，移除培养基，然后使用成骨诱导培养基继续培养，每3d更换一次成骨诱导培养基。培养7、14d后，将细胞裂解上清液与ALP显色液一起培养30min，并且将标准品和空白对照分别培养30min，后加入反应终止液终止反应，然后测定在405nm波长下的吸光度。通过吸光度计算ALP活性。
2 结果与讨论
2.1 涂层形貌分析
B-MAO和P-MAO涂层表面和横截面的微观形貌如图1所示。可以看出，B-MAO表面呈现出“类骨小梁”状多孔特征（见图1a）。“骨小梁”的厚度约为2μm，“骨小梁”状结构之间形成较大尺寸的微米级沟槽（槽宽5~8μm），在沟槽内部还分布着小尺寸的微米级孔洞（孔径在2μm左右）。结合涂层横截面形貌（见图1c）可以看出，涂层内部也存在较多更小尺寸的孔洞，这说明B-MAO涂层在膜厚方向上具有分级结构特征。与之对比，P-MAO涂层表面形貌（见图1b）呈现出典型的“火山坑”状多孔特征，孔的尺寸在3μm左右，有少量孔洞互连后形成沟槽，但相对来说其孔洞的形态和尺寸比较单一。P-MAO横截面形貌（见图1d）则显示出典型的微弧放电通道特征，放电通道以外区域和B-MAO涂层相比，孔洞较少，比较致密。从形貌上看，在纯钽表面利用Na2B4O7电解液获得的MAO涂层的孔隙率要高于利用Na3PO4制备的MAO涂层，出现这样的效果可能与四硼酸盐电解质对涂层微弧放电产物具有较强溶解作用有关[25]。
图 1 涂层表面及横截面形貌
2.2 涂层物相分析
B-MAO与P-MAO涂层的XRD谱图见图2，为了对比，图中也给出了微弧氧化前纯钽的XRD谱图。对照标准PDF卡片可知，B-MAO与P-MAO涂层的主要物相为Ta2O5（PDF#71-0639）。因为涂层的孔隙度高，X射线穿透深度较深，2种涂层谱图中均出现了基底纯Ta（PDF#04-0788）的衍射峰。
涂层表面的XPS分析结果如图3所示。其中，图3a—d为B-MAO的XPS分析结果，图3a为总谱，图3b、c、d分别为Ta4f、O1s、B1s的详细谱及分峰拟合结果。Ta4f在结合能25.80、27.69eV处存在2个特征峰，自旋分裂轨道为1.9eV，这与Ta5+的Ta4f5/2和Ta4f7/2特征峰吻合，接近Ta2O5的结合能[29]，但存在一定程度的偏移（见图3b）。结合能为530.06eV的特征峰则与Ta2O5的O1s结合能一致，证明了涂层表面Ta以Ta2O5的形式存在[30]（见图3c）。有研究表明，微弧氧化涂层表面会存在一层非晶层[25]，此处，Ta2O5的Ta4f峰位向更高结合能方向产生偏移，可能是涂层表面形成的Ta2O5为非晶态所致[31]。O1s中键能较高的峰位（531.64eV）对应于B2O3[32]，B1s峰位（191.52eV）对应的是B2O3，说明在B-MAO涂层中B以B2O3的形式存在（见图3d）。图2中XRD未检测到B2O3衍射峰，推测涂层中B2O3应来自于Na2B4O7电解质的热分解，且主要以非晶的形式在表面少量存在[25]。图3e—h为P-MAO的XPS分析结果。其中，图3e为XPS总谱，图3f、g、h分别为Ta4f、O1s、P2p的详细谱及分峰拟合结果。Ta4f在结合能26.14、28.05eV处同样存在2个特征峰，自旋分裂轨道近似为1.9eV，与Ta2O5的结合能也存在一定的偏移（见图3f），但考虑到在O1s详图中能够拟合出Ta2O5（530.43eV）特征峰（见图3g），可以确定P-MAO涂层中Ta以Ta2O5的形式存在。O1s中键能较高的峰位（531.43eV）对应于PO–，结合P2p在133.78eV处的峰位（见图3h），证明了P以PO–的形式存在。
这说明在P-MAO涂层微弧氧化制备过程中，由于涂层表面液体的急速冷却，使得少量Na3PO4电解质以非晶态沉积在涂层表面。
图 2 B-MAO 、P-MAO 涂层和纯 Ta 的 XRD 谱图
图 3 B-MAO 和 P-MAO 涂层的 XPS 图谱
2.3 涂层结合强度测试
十字划格测试后2种涂层切口的SEM形貌如图4所示。可以看出，P-MAO表面十字交叉部位有大片脱落，是涂层内部发生了开裂，说明涂层的结合力较差。B-MAO表面脱落现象不明显，切口比较平齐。根据ASTM法评级标准，P-MAO脱落面积在15%~35%，评级达到2B，而B-MAO划线边缘光滑，交叉点无涂层脱落，评级达到最高级5B。上述事实说明B-MAO涂层的结合力要优于P-MAO涂层。对涂层横截面形貌进行分析可知（见图1），2种涂层的内层和基体结合位置处均有一层相对较薄的致密层，致密层往外则是具有较多孔洞的中间疏松层。基体与涂层界面处的致密层因为是原位生长，与基体结合强度较高，也就说涂层与基体结合处发生开裂从而剥落的可能性较低。分析P-MAO涂层易从内部开裂的原因：一方面可能是涂层的结合力与承载面积有关，相较B-MAO涂层，P-MAO涂层的中间疏松层有较大的孔洞，使得涂层内部出现分层现象，承载面积缩减，从而使得在十字划格过程中涂层内部产生剥离并大面积脱落；另一方面，B-MAO表面的高孔隙度结构有助于释放微弧氧化过程中产生的热应力以及体积应力，而P-MAO表面的涂层孔隙度较低，涂层相对致密，在微弧氧化冷却过程中易形成残余应力，从而在十字划格过程中因内应力较大产生剥离[33]。
图 4 十字划格试验后 P-MAO 和 B-MAO 涂层表面切口的 SEM 形貌
2.4 不同表面粗糙度与亲水性
适宜的植入体表面粗糙度可促进更早、更强的骨整合，粗糙的表面是增强植入体与骨组织接触面积以及骨组织向内增长的潜力，并且成骨细胞对粗糙的表面有更好的附着能力[34-35]。使用激光共聚焦显微镜测量出的不同样品表面的三维轮廓如图5所示。粗糙度测量结果显示，机械抛光纯钽的Ra=0.06μm，P-MAO涂层的Ra=1.50μm，B-MAO涂层的Ra=1.58μm。说明B-MAO和P-MAO表面均为粗糙表面，均高于机械抛光纯钽，而且B-MAO表面的“类骨小梁”状多孔结构的粗糙度高于P-MAO表面。
提高植入物表面的亲水性可以有效刺激植入物和人体生物环境的交互作用，改善蛋白质、细胞等的粘附，从而促进骨整合[36-37]。亲水性可以用水接触角的大小来表示，接触角越小则亲水性越好。经测量，Ta、P-MAO和B-MAO的接触角分别为42.6°、15.5°和7.2°。可以看出，B-MAO的接触角低于P-MAO，两者的接触角又明显小于抛光Ta，说明微弧氧化后涂层的亲水性优于抛光纯Ta的亲水性。B-MAO的接触角小于10°,具有超亲水性特征，说明在B-MAO表面制备的“类骨小梁”状分级多孔结构对涂层亲水性的提高有一定的促进作用。有研究表明，接触角随样品表面粗糙度的变化而变化，在理想情况下满足Wenzel模型：cosθm=rcosθγ。式中：θm为测量所得接触角；θγ为材料的杨氏接触角；r为粗糙度因子（实际的固液接触面积与表观固液接触面积之比，r>1，与粗糙度大小有关）[38]。上述理论意味着，对于本征亲水性（杨氏接触角小于90°)的表面，粗糙的表面对其亲水性有放大作用。此处，2种微弧氧化涂层的成分均为具有极性的Ta2O5，其本身是亲水性的，因此粗糙的微弧氧化涂层的亲水性明显好于抛光纯Ta，而B-MAO涂层的粗糙度又大于P-MAO涂层，所以其亲水性理论上要更优。另外，相较于P-MAO分立的孔洞结构，B-MAO的“类骨小梁”状涂层表面沟槽状特征明显，孔洞更为互连联通，其较强的毛细作用能进一步增加其亲水性，使其达到超亲水性状态。
2.5 不同表面细胞相容性
细胞在纯Ta、P-MAO和B-MAO表面培养1、2、4h后的荧光染色图像如图6所示。1h时，在3种形貌表面细胞均呈现圆形，且P-MAO和B-MAO涂层表面的细胞数量多于Ta表面细胞数量，说明初期P-MAO和B-MAO涂层的细胞粘附能力高于抛光Ta。随着时间的增加，细胞逐渐在表面铺展，且在2h时细胞形态发展为多边形，部分细胞有伪足出现。4h时，细胞伪足进一步扩展，丝状伪足增多。说明前期纯Ta表面、P-MAO和B-MAO涂层均具有良好的细胞铺展性能。图6b为细胞铺展的SEM形貌图像，通过观察可进一步对比表面结构对细胞铺展及粘附的影响。2h培养的SEM图像中，B-MAO相较于P-MAO细胞粘附数量较多，并且在4h时，B-MAO细胞形貌出现了明显的变化，伪足数量较多。在较长的24h时间点上，B-MAO涂层表面细胞铺展已经比较充分，且B-MAO涂层的细胞铺展能力优于P-MAO涂层和抛光纯Ta表面。Fiedler等[39]研究认为，不同的表面结构会使得细胞膜上的肌动蛋白纤维产生不同的应力，进而有不同的铺展速度。本文B-MAO表面相较于P-MAO表面更有利于细胞丝状伪足的延伸与铺展，应该与其独特的“类骨小梁”状分级多孔结构有关。
图 5 不同表面的 3D 形貌和水接触角测试结果
图 6 细胞在 Ta 、P-MAO 、B-MAO 表面上培养不同时间的荧光染色图像和 SEM 图像
细胞在Ta、P-MAO和B-MAO涂层表面培养1、3、5d的CCK-8检测结果如图7所示。由结果可知，3种形貌表面的细胞数量随着时间的增加均呈明显增加趋势，说明3种表面均没有细胞毒性。细胞培养1d时，3种表面的细胞增殖能力排序为B-MAO>P-MAO>Ta，P-MAO和Ta表面细胞增殖存在统计学上差异（p<0.05），B-MAO和P-MAO则存在显著性差异（p<0.01）。3d时，这种差异继续存在，不过B-MAO和P-MAO之间的差异稍微降低（p<0.05）。5d时，B-MAO的细胞增殖能力最优，与P-MAO、纯Ta的差异性显著（p值分别小于0.001和0.01）。虽然5d时纯Ta的细胞增殖能力要好于P-MAO，但它们之间不存在统计学上差异（p>0.05）。分析出现这种现象的原因可能是在长时间的细胞培养情况下，单级结构和抛光Ta表面细胞均已铺满，而在B-MAO表面形成的明显纵向分级结构下，细胞有向内生长的趋势，更有利于细胞在涂层上生长。有研究表明，比表面积大、联通性较高的形貌有助于细胞的粘附、增殖[40]，这与本实验观察到的结果相符。
图 7 Ta 、P-MAO 和 B-MAO 表面在 1 、3、5 d 时的 CCK-8 法细胞增殖能力测试（ ns p>0.05,* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, n=3 ）
细胞成骨诱导7、14d后，Ta、P-MAO和B-MAO表面ALP活性定量结果如图8所示。可以看出，随着时间的增加，细胞在不同形貌表面的ALP活性均明显增加，在7、14d时，Ta和P-MAO涂层表面的ALP活性没有统计学上差异，但在14d时，P-MAO涂层ALP平均值要好于纯Ta。2个时间点上，B-MAO涂层的ALP活性均表现最优，与前两者具有显著性差异。有研究表明，粗糙度高的表面有利于细胞分化[41]，本文的结果也验证了这一点。对比B-MAO和P-MAO可知，两者表面化学组成相似，导致两者ALP活性存在差异的原因可能是其表面结构的不同。由于ALP是细胞早期成骨标志物，因此上述结果可以说明，相较于P-MAO的单级结构，B-MAO涂层形成的多孔分级结构更能促进细胞成骨分化。
图 8 MC3T3-E1 细胞成骨诱导 7 、14 d 后 Ta、P-MAO 和 B-MAO 表面 ALP 活性（ ns p>0.05,** p<0.01, n= 3 ）
3 结论
1）使用微弧氧化方法，并利用Na2B4O7和Na3PO4电解液在纯钽表面分别制备出了“类骨小梁”状分级多孔和“火山坑”状单级多孔涂层，2涂层组成成分主要为Ta2O5。
2）微弧氧化涂层相较于机械抛光态纯钽表面具有更高的粗糙度以及亲水性，同时具有更高的细胞粘附和增殖能力。
3）相较于“火山坑“状涂层，“类骨小梁”状多孔涂层的结合力更强，具有更高的粗糙度以及超亲水特性，在细胞粘附、铺展、增殖以及成骨分化能力方面性能优异，在硬组织替代领域应用具有较大的潜力。
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